Utilizarea și precauțiile tubului centrifugă de ultrafiltrare
1) Alegeți un tub de ultrafiltrare adecvat.Rețineți că membranele UF diferă în ceea ce privește nivelul lor de toleranță la diferite substanțe chimice.În mod obișnuit, tuburile de ultrafiltrare cu o limită de greutate moleculară de 10 kDa pot fi selectate cu o limită de greutate moleculară care nu ar trebui să fie mai mare de 1/3 din greutatea moleculară a proteinei de interes, cum ar fi 35 kDa.Dacă greutatea moleculară a proteinei de interes este în jur de 10 kd, se poate utiliza un tub de ultrafiltrare cu o limită de greutate moleculară de 3 KD.
(2) Ultrafiltrarea, proaspăt cumpărată, este uscată, cu apă ultrapură adăugată înainte de utilizare și apă trecută complet prin membrană, baie de gheață sau frigider prerăcită pentru câteva minute.Se toarnă apoi apa, adică lichidul proteic și cât se adaugă, oricare dintre acestea nu depășește linia albă din partea de sus a tubului.Operația este ușoară, iar tubul de ultrafiltrare trebuie să fie prerăcit pe gheață înainte de a adăuga soluția de proteine.
3) Atât masa, cât și centrul de greutate urmau să ajungă la echilibru.Rețineți că viteza de rotație și accelerația nu sunt foarte rapide, altfel dăunând direct membrana de ultrafiltrare.S-a început ultrafiltrarea centrifugă (centrifugă prerăcită la 4 grade).După ce RPM diferitelor centrifuge a fost convertit în g, a fost diferit.Accelerația centrifugei a fost reglată la minimum, reducând presiunea asupra membranei.Rețineți, asigurați-vă că părăsiți centrifuga după ce centrifuga a atins viteza de destinație sau, dacă aveți o problemă, nu o puteți face față pentru prima dată.Orientarea membranei față de ax a fost ajustată conform instrucțiunilor (carcasa unghiulară a centrifugei este perpendiculară membrană pe axă).În utilizare practică, viteza generală de rotație este mai mică decât cea din instrucțiuni, astfel încât durata de viață a tubului de centrifugă poate fi prelungită.
3) Atât masa, cât și centrul de greutate urmau să ajungă la echilibru.Rețineți că viteza de rotație și accelerația nu sunt foarte rapide, altfel dăunând direct membrana de ultrafiltrare.S-a început ultrafiltrarea centrifugă (centrifugă prerăcită la 4 grade).După ce RPM diferitelor centrifuge a fost convertit în g, a fost diferit.Accelerația centrifugei a fost reglată la minim, reducând presiunea asupra membranei.Rețineți, asigurați-vă că părăsiți centrifuga după ce centrifuga a atins viteza de destinație sau, dacă aveți o problemă, nu o puteți face față pentru prima dată.Orientarea membranei față de ax a fost ajustată conform instrucțiunilor (carcasa unghiulară a centrifugei este perpendiculară membrană pe axă).În utilizare practică, viteza generală de rotație este mai mică decât cea din instrucțiuni, astfel încât durata de viață a tubului de centrifugă poate fi prelungită.
(4) Când se concentrează până la 1 ml rămas, se iau 50 ul de soluție tampon, se adaugă 10 ul de curgere și se vede dacă există o culoare albastră, pentru a stabili dacă tubului de ultrafiltrare îi lipsește proteine.Dacă tubul prezintă scurgeri, turnați din nou stratul superior și curgeți într-un tub nou pentru a începe ultrafiltrarea.Pentru a determina cu precizie dacă tuburile au omis, centrifugați timp de 10 minute cu 5 mg ml de BSA înainte de curgere, rulând pe lipici proteic sau test Bradford brut și continuați prin adăugarea soluției de proteine concentrate rămase (care funcționează pe gheață și împiedică încălzirea proteinelor) până când tot concentratul a fost adăugat.Aveți grijă în timpul centrifugării dacă are loc precipitarea proteinelor, ceea ce duce la închiderea tubului.Dacă are loc precipitații, determinați dacă cauza specifică a precipitației este o concentrație excesivă de proteine sau un tampon inadecvat;Prima poate fi rezolvată prin ultrafiltrarea mai multor tuburi de ultrafiltrare simultan, scăzând concentrația, iar cea din urmă prin schimbul de soluții tampon diferite până când nu are loc nicio precipitare a proteinei.
(4) Când se concentrează până la 1 ml rămas, se iau 50 ul de soluție tampon, se adaugă 10 ul de curgere și se vede dacă există o culoare albastră, pentru a stabili dacă tubului de ultrafiltrare îi lipsește proteine.Dacă tubul prezintă scurgeri, turnați din nou stratul superior și curgeți într-un tub nou pentru a începe ultrafiltrarea.Pentru a determina cu precizie dacă tuburile au omis, centrifugați timp de 10 minute cu 5 mg ml de BSA înainte de curgere, rulând pe lipici proteic sau test Bradford brut și continuați prin adăugarea soluției de proteine concentrate rămase (care funcționează pe gheață și împiedică încălzirea proteinelor) până când tot concentratul a fost adăugat.Aveți grijă în timpul centrifugării dacă are loc precipitarea proteinelor, ceea ce duce la închiderea tubului.Dacă are loc precipitații, determinați dacă cauza specifică a precipitației este o concentrație excesivă de proteine sau un tampon inadecvat;Prima poate fi rezolvată prin ultrafiltrarea mai multor tuburi de ultrafiltrare simultan, scăzând concentrația, iar cea din urmă prin schimbul de soluții tampon diferite până când nu are loc nicio precipitare a proteinei.
(5) Primii pași sunt utilizați pentru concentrarea proteinei și, dacă tamponul urmează să fie schimbat, adăugați ușor tampon nou (ultrafiltrare printr-o membrană de ultrafiltrare de 0,22 um) la aproximativ 1 ml de proteină totală și reconcentrați la aproximativ 1 ml timp de trei de ori consecutiv, cu volumul final concentrat final în funcție de concentrația dorită de proteine, în general nu mai mult de 500 ul, dar și până la 200 ul.Obține 1000 × sau mai mult de trei ori, în esență la fel de multă modificare a tamponului, calculată prin îmbogățirea volumului de cel puțin 10 × aproximativ de fiecare dată.
(5) Primii pași sunt utilizați pentru concentrarea proteinei și, dacă tamponul trebuie schimbat, adăugați ușor tampon nou (ultrafiltrare printr-o membrană de ultrafiltrare de 0,22 um) la aproximativ 1 ml de proteină totală și reconcentrați la aproximativ 1 ml timp de trei de ori consecutiv, cu volumul final concentrat final în funcție de concentrația dorită de proteine, în general nu mai mult de 500 ul, dar și până la 200 ul.Obține 1000 × sau mai mult de trei ori, în esență la fel de multă modificare a tamponului, calculată prin îmbogățirea volumului de cel puțin 10 × aproximativ de fiecare dată.
Ora postării: 09-nov-2022