PCR, este reacția în lanț a polimerazei, care se referă la adăugarea de dNTP, Mg2+, factori de alungire și factori de îmbunătățire a amplificarii în sistem sub cataliza ADN polimerazei, folosind ADN-ul părinte ca șablon și primeri specifici ca punct de plecare al extensiei, Prin etapele de denaturare, recoacere, extensie etc., procesul de replicare in vitro a ADN-ului catenei fiice complementare cu ADN-ul matriță al catenei părinte poate amplifica rapid și specific orice ADN țintă in vitro.
1. Hot Start PCR
Ora de pornire a amplificării în PCR convențional nu este de a pune mașina PCR în mașina PCR, iar apoi programul începe să se amplifice.Când configurarea sistemului este finalizată, începe amplificarea, ceea ce poate provoca o amplificare nespecifică, iar PCR cu pornire la cald poate rezolva această problemă.
Ce este PCR cu pornire la cald?După ce sistemul de reacție este pregătit, modificatorul enzimatic este eliberat la temperatură ridicată (de obicei mai mare de 90°C) în timpul etapei inițiale de încălzire a reacției sau a etapei de „pornire la cald”, astfel încât ADN polimeraza este activată.Timpul exact de activare și temperatura depind de natura ADN polimerazei și de modificatorul de pornire la cald.Această metodă utilizează în principal modificatori precum anticorpi, liganzi de afinitate sau modificatori chimici pentru a inhiba activitatea ADN polimerazei.Deoarece activitatea ADN polimerazei este inhibată la temperatura camerei, tehnologia de pornire la cald oferă o mare comoditate pentru prepararea mai multor sisteme de reacție PCR la temperatura camerei fără a sacrifica specificitatea reacțiilor PCR.
2. RT-PCR
RT-PCR (PCR cu transcripție inversă) este o tehnică experimentală pentru transcrierea inversă din ARNm în ADNc și utilizarea acesteia ca șablon pentru amplificare.Procedura experimentală este de a extrage mai întâi ARN total în țesuturi sau celule, utilizați Oligo (dT) ca primer, utilizați transcriptaza inversă pentru a sintetiza ADNc și apoi utilizați ADNc ca șablon pentru amplificarea PCR pentru a obține gena țintă sau pentru a detecta expresia genei.
3. PCR cantitativ fluorescent
PCR cantitativ fluorescent (PCR cantitativ în timp real,RT-qPCR) se referă la metoda de adăugare a grupelor fluorescente la sistemul de reacție PCR, folosind acumularea de semnale fluorescente pentru a monitoriza întregul proces PCR în timp real și, în final, folosind curba standard pentru a analiza cantitativ șablonul.Metodele qPCR utilizate în mod obișnuit includ SYBR Green I și TaqMan.
4. PCR imbricat
PCR imbricată se referă la utilizarea a două seturi de primeri PCR pentru două runde de amplificare PCR, iar produsul de amplificare din runda a doua este fragmentul genei țintă.
Dacă o nepotrivire a primei perechi de primeri (primeri exteriori) determină amplificarea unui produs nespecific, posibilitatea ca aceeași regiune nespecifică să fie recunoscută de a doua pereche de primeri și să continue să se amplifice este foarte mică, deci amplificarea prin a doua pereche de primeri, specificitatea PCR a fost îmbunătățită.Un avantaj al efectuării a două runde de PCR este că ajută la amplificarea unui produs suficient din ADN inițial limitat.
5. Touchdown PCR
Touchdown PCR este o metodă de îmbunătățire a specificității reacției PCR prin ajustarea parametrilor ciclului PCR.
În PCR cu touchdown, temperatura de recoacere pentru primele câteva cicluri este setată cu câteva grade peste temperatura maximă de recoacere (Tm) a primerilor.O temperatură mai mare de recoacere poate reduce în mod eficient amplificarea nespecifică, dar, în același timp, o temperatură mai mare de recoacere va agrava separarea primerilor și a secvențelor țintă, rezultând un randament PCR redus.Prin urmare, în primele câteva cicluri, temperatura de recoacere este de obicei setată să scadă cu 1°C pe ciclu pentru a crește conținutul genei țintă din sistem.Când temperatura de recoacere este scăzută la temperatura optimă, temperatura de recoacere este menținută pentru ciclurile rămase.
6. PCR directă
PCR directă se referă la amplificarea ADN-ului țintă direct din probă, fără a fi necesară izolarea și purificarea acidului nucleic.
Există două tipuri de PCR directă:
metoda directă: luați o cantitate mică de probă și adăugați-o direct în PCR Master Mix pentru identificarea PCR;
metoda de cracare: după eșantionarea probei, adăugați-o la lizat, lizați pentru a elibera genomul, luați o cantitate mică de supernatant lizat și adăugați-o la PCR Master Mix, efectuați identificarea PCR.Această abordare simplifică fluxul de lucru experimental, reduce timpul de lucru și evită pierderea ADN-ului în timpul etapelor de purificare.
7. SOE PCR
Splicing-ul genelor prin suprapunere PCR (SOE PCR) folosește primeri cu capete complementare pentru a face ca produsele PCR să formeze lanțuri suprapuse, astfel încât în reacția de amplificare ulterioară, prin extinderea lanțurilor suprapuse, diferite surse ale tehnicii A în care fragmentele amplificate sunt suprapuse. și îmbinate împreună.Această tehnologie are în prezent două direcții principale de aplicare: construcția genelor de fuziune;mutație direcționată pe site-ul genei.
8. IPCR
PCR inversă (IPCR) utilizează primeri complementari inversi pentru a amplifica fragmente de ADN, altele decât cei doi primeri, și amplifică secvențe necunoscute de pe ambele părți ale unui fragment de ADN cunoscut.
IPCR a fost conceput inițial pentru a determina secvența regiunilor adiacente necunoscute și este folosit în principal pentru a studia secvențele promotoare ale genelor;rearanjamente cromozomiale oncogene, cum ar fi fuziunea genică, translocarea și transpunerea;și integrarea genelor virale, sunt de asemenea utilizate în mod obișnuit acum. Pentru mutageneza direcționată pe situs, copiați o plasmidă cu mutația dorită.
9. dPCR
Digital PCR (dPCR) este o tehnică pentru cuantificarea absolută a moleculelor de acid nucleic.
În prezent, există trei metode de cuantificare a moleculelor de acid nucleic.Fotometria se bazează pe absorbanța moleculelor de acid nucleic;PCR cantitativ fluorescent în timp real (PCR în timp real) se bazează pe valoarea Ct, iar valoarea Ct se referă la numărul ciclului corespunzător valorii fluorescenței care poate fi detectată;PCR digitală este cea mai recentă tehnologie cantitativă bazată pe metoda PCR cu o singură moleculă pentru numărarea acidului nucleic. Cuantificarea este o metodă cantitativă absolută.
Ora postării: 13-jun-2023